≡× MENÜ

• Vízellátás
• Szivattyúk
• Víz tisztítás
• Wells
• Szűrők

Nátrium-foszfát puffer. Foszfát pufferoldat készítése Foszfát pufferoldat készítése

A PBS (foszfáttal pufferolt sóoldat) egy általánosan használt puffer immunhisztokémiai festéshez, és gyakran használják a biológiai kutatásokban. Az oldatok ozmolaritása és ionjainak koncentrációja megfelel az emberi test koncentrációjának (izotóniás).

A PBS egy vízbázisú oldat, amely nátrium-hidrogén-foszfátot, nátrium-kloridot és bizonyos esetekben kálium-kloridot és kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz.

Immunfluoreszcens festés IHC-hez

Az immunfluoreszcens festés volt az első immunhisztokémiai (IHC) festési módszer. Az antigén-antitest kötési reakció alapján az antigének láthatóvá válnak fluoreszcens festékek segítségével, ha antitestekkel konjugálnak. A folyamat akkor következik be, amikor egy adott hullámhosszú gerjesztő fény aktiválja fluoreszcens mikroszkóp alatt. Az immunhisztokémia az antigének (például fehérjék) kimutatásának folyamatát jelenti egy szövetmetszet sejtjeiben, a biológiai szövetekben lévő antigénekhez specifikusan kötődő antitestek elve alapján.

foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) használata

A foszfáttal pufferolt sóoldat számos felhasználási területtel rendelkezik, mivel izotóniás és nem toxikus a legtöbb sejtre. Használható anyagok hígításához és sejteket tartalmazó tartályok öblítésére. A PBS hígítóként használható a biomolekulák szárítási módszereiben, mivel a benne lévő vízmolekulák az anyag (például fehérje) körül strukturálódnak, hogy „szárítsák” és szilárd felületre rögzítsék.

Az anyaghoz kötődő vékony vízréteg megakadályozza a denaturációt vagy más konformációs változásokat. A karbonát pufferek ugyanerre a célra használhatók, de kisebb hatékonysággal. A PBS referenciaspektrum biztosítására is használható a fehérje adszorpciójának ellipszometriás mérése során.

PBS készítése

A PBS elkészítésének sokféle módja van.

Egyes tápszerek nem tartalmaznak káliumot, míg mások kalciumot vagy magnéziumot tartalmaznak. Az alábbi pufferrecept, amely viszonylag egyszerű, 10-szeres PBS (0,1 M) törzsoldathoz készült. Lehetőség van Tween hozzáadására is. Az egész folyamat körülbelül 10 percet vesz igénybe.

Foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) készítése

1. Mérjük meg a következőket: 10,9 g vízmentes kétbázisú nátrium-foszfát (Na2HPO4), 3,2 g vízmentes egybázisú nátrium-foszfát (NaH2PO4) és 90 g nátrium-klorid (NaCl).
2. A fentieket csak 1 liter desztillált vízben oldja fel.
3. Állítsa a pH-értéket 7-re. 4.
4. Az oldatot 1 liter végső térfogatra készítjük.
5. (nem szükséges). 0,5% Tween 20-at tartalmazó oldat esetén adjon hozzá 5 ml Tween 20-at az 1 literes oldathoz.
6. Használat előtt 10X hígítsa fel, és szükség esetén állítsa be a pH-t.

• Szobahőmérsékleten tárolandó.
• A nem femorális reagensek helyettesíthetők, de mindegyikük megfelelő tömegét újra kell számolnia a hozzáadott vízmolekulák befogadásához.

Mi kell a PBS puffer létrehozásához?

• Egyfázisú nátrium-foszfát (vízmentes)
• Kétbázisú nátrium-foszfát (vízmentes)
• Nátrium-klorid
• Mérleg- és súlycsónakok
• Mágneses keverő és keverő > pH-szonda, kalibrált és megfelelő oldatok a pH beállításához
• 1 literes mérőlombik
• Tween 20 (opcionális)

A pufferoldatok pH-értékét a Henderson–Hasselbach egyenlet segítségével számítjuk ki:

– savas puffer esetén az egyenlet alakja

– a fő pufferhez

Az egyenletek azt mutatják, hogy egy adott összetételű pufferoldat pH-ját a sav és a só vagy a bázis és a só koncentrációjának aránya határozza meg, ezért nem függ a hígítástól. Ha az oldat térfogata változik, akkor az egyes komponensek koncentrációja ugyanannyiszor változik.

Puffer kapacitás

A pufferoldatok állandó pH-értéket fenntartó képessége korlátozott. Azok. sav vagy lúg hozzáadása a pufferoldat pH-értékének jelentős megváltoztatása nélkül csak korlátozott mennyiségben lehetséges.

Azt az értéket, amely jellemzi a pufferoldat azon képességét, hogy ellensúlyozza a közeg reakciójának kiszorítását savak és lúgok hozzáadásakor, az oldat pufferkapacitásának nevezzük (B).

A pufferkapacitást egy erős sav vagy lúg ekvivalensének móljaiban mérjük, amelyet 1 liter pufferoldathoz adva eggyel megváltoztatjuk a pH-t.

Matematikailag a pufferkapacitás meghatározása a következő:

B sav szerint (mol/l vagy mmol/l):

,

ahol n(1/z HA) a savegyenértékek mólszáma, pH 0 és pH a pufferoldat pH-ja a sav hozzáadása előtt és után, V B a pufferoldat térfogata.

Lúgban (mol/l vagy mmol/l):

,

ahol n (1/z BOH) az alkáli ekvivalensek mólszáma, a többi elnevezés megegyezik.

A puffer kapacitása számos tényezőtől függ:

1. A hozzáadott anyagok és a pufferoldat komponenseinek jellegéből. Mert Egyes anyagok oldhatatlan vegyületeket vagy komplexeket képezhetnek, vagy egyéb nemkívánatos reakciókat válthatnak ki a pufferrendszer komponenseivel, ekkor a pufferkapacitás fogalma értelmét veszti.

2. A pufferrendszer komponenseinek kezdeti koncentrációjából.

Minél több a sav-bázis pár komponenseinek száma egy oldatban, annál nagyobb az oldat pufferkapacitása.

A pufferoldat komponenseinek azon koncentrációinak arányának határa, amelynél a rendszer még megőrzi tulajdonságait. A pH intervallum = pK ± 1 a rendszer pufferzónájának nevezzük. Ez a só/só arány 1/10 és 10/1 közötti tartományának felel meg.

In k (vér) = 0,05 mol/l; V to (plazma) = 0,03 mol/l; V to (szérum vér) = 0,025 mol/l

Vérpuffer rendszerek

A pufferrendszerek különösen fontosak az élőlények sav-bázis egyensúlyának fenntartásában. A legtöbb intracelluláris folyadék pH-értéke 6,8 és 7,8 között van.

Az emberi vér sav-bázis egyensúlyát a szénhidrogén-, foszfát-, fehérje- és hemoglobin pufferrendszerek biztosítják. A vérplazma normál pH-értéke 7,40 ± 0,05.

A hemoglobin pufferrendszer biztosítja a vér 35%-os pufferkapacitását: . Az oxihemoglobin erősebb sav, mint a redukált hemoglobin. Az oxihemoglobin általában káliumsó formájában jelenik meg.

Karbonát puffer rendszer : Erejét tekintve az első helyen áll. 1/20 arányban szénsav (H 2 CO 3) és nátrium- vagy kálium-hidrogén-karbonát (NaHCO 3, KHCO 3) képviseli. A bikarbonát puffert széles körben használják a szervezet sav-bázis állapotának rendellenességeinek korrigálására.

Foszfát puffer rendszer . A dihidrogén-foszfát gyenge sav tulajdonságokkal rendelkezik, és kölcsönhatásba lép a vérbe jutó lúgos termékekkel. A hidrogén-foszfát gyenge lúg tulajdonságaival rendelkezik, és reagál erősebb savakkal.

A fehérjepufferrendszer amfoter tulajdonságai miatt savak és lúgok semlegesítő szerepét tölti be: savas környezetben a plazmafehérjék bázisként, bázikus környezetben - savaként viselkednek:

A szövetekben is jelen vannak pufferrendszerek, amelyek segítenek a szövet pH-jának viszonylag állandó szinten tartásában. A fő szöveti pufferek a fehérjék és a foszfátok. A pH-t a tüdő és a vese is fenntartja. A felesleges szén-dioxid a tüdőn keresztül távozik. Acidózis esetén a vesék több savas, egybázisú nátrium-foszfátot választanak ki, alkalózis esetén pedig több lúgos sót: kétbázisú nátrium-foszfátot és nátrium-hidrogén-karbonátot.

Példák problémamegoldásra

Megoldás:

Kiszámítjuk egy savas pufferoldat pH-ját a képlet segítségével, majd

Válasz: 5,76

Megoldás:

A pufferkapacitást a következő képlettel számítjuk ki:

Válasz: 0,021 mol/l

3. példa

A pufferoldat 100 ml 0,1 mol/l-es ecetsavból és 200 ml 0,2 mol/l-es nátrium-acetátból áll. Hogyan változik ennek az oldatnak a pH-ja, ha 30 ml 0,2 mol/l-es nátrium-hidroxid oldatot adunk hozzá?

Megoldás:

A pufferoldat pH-ját a következő képlettel számítjuk ki:

Ha NaOH-t adunk a pufferoldathoz, a só mennyisége nő, és a pufferoldatban a sav mennyisége csökken:

0,006 0,006 0,006

CH 3 COOH + NaOH = CH 3 COONa + H 2 O

Számítunk n (NaOH) = 0,03 l · 0,2 mol/l = 0,006 mol, ezért a pufferoldatban a sav mennyisége 0,006 mol-al csökken, a só mennyisége pedig 0,006 mol-mal nő.

Az oldat pH-ját a következő képlettel számítjuk ki:

Tehát: pH 2 – pH 1 = 5,82 – 5,3 = 0,52

Válasz: a pufferoldat pH-jának változása = 0,52.

Önállóan megoldandó problémák

4. 2 ml vér titrálásához a pH kezdeti értékről (7,36) a végső értékre (7,0) történő megváltoztatásához 1,6 ml 0,01 M HCl-oldatot kellett hozzáadni. Számítsa ki a savpuffer kapacitását!

5. Hány mol nátrium-acetátot kell hozzáadni 300 ml ecetsavhoz, hogy a hidrogénionok koncentrációja 300-szorosára csökkenjen (K dis (CH 3 coon) = 1,85,10 -5).

6. A biokémiai vizsgálatokhoz pH = 7,4 foszfátpuffert használunk. Milyen arányban kell összekeverni a nátrium-hidrogén-foszfát és a nátrium-dihidrogén-foszfát 0,1 mol/l koncentrációjú oldatait, hogy ilyen pufferoldatot kapjunk (pK(H 2 PO 4 -) = 7,4).

7. A CBS milyen megsértését figyelték meg a következő mutatók: vér pH = 7,20, Pco 2 = 38 Hgmm. Art., BO = 30 mmol/l, SBO = -4 mmol/l. Hogyan lehet megszüntetni a CBS megsértését?

Tesztfeladatok

Vérvétel, „vékony kenet” és „vastag csepp” elkészítése

A baktériumok mozgása. A flagellum szerkezete, vastagsága, hossza, kémiai összetétele. Fix készítmények és mikroorganizmusok élő sejtjeinek készítményei.

A pufferoldatok készítéséhez vegyi minőségű reagenseket használnak. és analitikai minőségű, speciálisan előkészítve. A reagensek előkészítése a következőképpen történik.

Kálium-foszfát monoszubsztituált, KH 2 PO 4 , molekulatömeg 136,09. 100 g gyógyszert forrásig melegítve feloldunk 150 ml vízben. Az oldatot forrón szűrjük. Folyamatos keverés mellett a szűrletet 10 °C-ra hűtjük. Ezután adjunk hozzá 150 ml etil-alkoholt. A szűrlet állandó keverése során felszabaduló kristályokat szívótölcséren leszűrjük, és azonos körülmények között újra átkristályosítjuk. a kristályokat tömegállandóságig szárítjuk 105…110 ºC-on. Ha van olyan gyógyszer, amelynek főanyag-tartalma 99,9...100,0% tartományba esik, az anyag előzetes előkészítésére nem kerül sor.

Diszubsztituált nátrium-foszfát, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, molekulatömege 358,12. A gyógyszer elkészítésének két módja van.

a) 150 g gyógyszert 100 0 C-ra melegítve 150 ml vízben feloldunk. Az oldatot forrón szűrjük, majd lehűlés után a kivált kristályokat kiszűrjük. Az átkristályosítást 100 ºC-ra való melegítéssel megismételjük. Az átkristályosodott drogot porcelánpohárban vízfürdőben, folyamatos keverés mellett addig melegítjük, amíg a drog teljesen megszárad. A kapott sót exszikkátorban olvasztott kalcium-klorid felett szárítjuk 24 órán át. Ellenőrizzük az átkristályosított készítmény főanyag-tartalmát (Na 2 HPO 4 · 2H 2 O). Ehhez körülbelül 0,5000 g gyógyszert 50 ml vízben feloldunk, 2...3 ml telített nátrium-klorid oldatot adunk hozzá, és metilvörös indikátor jelenlétében 0,1 N sósavoldattal titráljuk. Ha szükséges, módosítsa a minta méretét. 1 ml pontosan 0,1 N sósavoldat 0,0178 g Na 2 HPO 4 2H 2 O-nak felel meg.

b) 75 g gyógyszert feloldunk 250 ml 60 ºC-ra melegített vízben. Az oldatot forrón szűrjük, a szűrletet folyamatos keverés közben 10 ºC-ra hűtjük. A kivált kristályokat szívótölcséren leszűrjük, és azonos körülmények között újra átkristályosítjuk. A kapott sót először 30 ºC-ot meg nem haladó hőmérsékleten 24 órán át szárítjuk, majd kemencében 50 ºC-on 3...4 órán át, végül 120±5 ºC-on tömegállandóságig szárítjuk, megakadályozva a só kialakulását. az olvadástól. Szárítás után a só Na 2 HPO 4 összetételű.

A reagensek elkészítése után készítse el a monoszubsztituált kálium-foszfát és a kétbázisú nátrium-foszfát kezdeti oldatát.

A vízmentes kálium-foszfát monoszubsztituált KH 2 PO 4 9,078 g tömegű mintáját vízben oldjuk, és az oldat térfogatát 1 literre állítjuk be. Az oldat stabilizálására adjunk hozzá 3...4 csepp toluolt.

Egy 11,876 g tömegű nátrium-foszfáttal diszubsztituált Na2HPO4·12H2O-mintát vízben oldunk, és az oldat térfogatát 1 literre állítjuk be. Az oldat stabilizálására adjunk hozzá 3...4 csepp toluolt.

A kiindulási oldatokból 4,94 és 9,18 közötti pH-jú foszfát pufferoldatokat készítünk az A.2. táblázat szerint.

A.2. táblázat – Foszfát pufferoldat, pH 4,94...9,18

pH	oldat Na 2 HPO 4 12H 2 O, ml	KH 2 PO 4 oldat, ml
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,67	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0

Hozzáadás dátuma: 2015-08-06 | Megtekintések: 4058 |

A hematológiai vizsgálatokhoz szükséges biológiai anyag gyűjtésének és előkészítésének követelményei.

A hematológiai vizsgálatokhoz szükséges biológiai anyagok szállításának és tárolásának követelményei.

A hemosztázis rendszer vizsgálatára vonatkozó beutaló helyes kitöltése:

A beteg teljes neve, életkora, neme

A kutatáshoz szükséges vérvétel ideje

Klinikai diagnózis (röviden)

Hematokrit

Hemorrhagiás szindróma (orr-, méhvérzés stb.), trombózis (határozza meg a helyét), sokk, többszörös szervi elégtelenség, trauma, elhúzódó kompressziós szindróma, égés stb.

Tüntesse fel a vérzéscsillapító paramétereket befolyásoló gyógyszereket, az adagot, az utolsó beadás módját és dátumát

A mintavétel (vér) időintervallumát, az étrendi és a testmozgási korlátozásokat be kell tartani:

A rutin vérvétel reggel 7 és 9 óra között történik, a beteg fekvő vagy ülve. A vérzéscsillapítás dinamikai vizsgálatakor célszerű az előző mintavétellel azonos testhelyzetben vérmintát venni.

A vért éhgyomorra veszik, 12-14 órával az utolsó étkezés után.

A vérvétel előtt tanácsos a betegnek 15 percet pihenni.

Kivételek: hemosztázis vizsgálatok cito által, APTT értékelés.

A tervezett vizsgálat előestéjén (24 órán belül) a beteg tartózkodik a jelentős fizikai aktivitástól és az alkoholfogyasztástól. A vérvétel előestéjén tanácsos, hogy a beteg ne egyen zsíros ételeket.

A sebészeti beavatkozás a hemosztázis változásához vezet néhány naptól több hétig.

A vérzéscsillapítást befolyásoló tényezők közé tartoznak az injekciók, infúziók, transzfúziók, szúrások, biopsziák, masszázs, dialízis, radiokontraszt szerek adása, immunszcintográfia, ionizáló sugárzás, endoszkópos vizsgálat és speciális diéták.

A VÉRVETÉS SZABÁLYAI

A vért egy perifériás vénából (általában az ulnaris vénából) veszik.

A vért csak vákuumgyűjtő rendszerrel gyűjtik a használt véralvadásgátlótól függően speciális színjelzéssel ellátott csövekbe ( nátrium-citrát 3,2%) arányban: 1 térfogat nátrium-citrát 9 térfogat vérhez.

Kutatásra vérlemezke szint vért vesznek egy kémcsőbe EDTA-val(lila színű jelölés). Vérlemezkeszint-vizsgálatot írnak elő klinikai vérvizsgálat hiányában, vagy ha klinikai vérvizsgálat során patológiás vérlemezkeszintet állapítanak meg

Az érszorító rövid távú alkalmazása elfogadható, legfeljebb 60 másodperc. Azonnal távolítsa el az érszorítót, miután a tű bejutott a vénába. A véralvadási rendszer vizsgálatához szükséges vér gyűjtéséhez fontos, hogy ne masszírozhassa a vénákat, és ne kopogtasson rájuk.

Használjon 0,7-1 mm belső átmérőjű vérvételi tűt (19-22-es méret).

A fecskendő használata elfogadhatatlan, mivel a vér turbulens mozgása és levegővel való keveredése (habzás) aktiválja a vérlemezkéket és a véralvadási faktorokat. Ez kiküszöbölhető vákuumtartályok használatakor.

Miután beszúrta a tűt a vénába, rögzítsen egy vákuumtartályt, a vér a gravitáció hatására elkezd folyni a tartályba.

Vegyünk vért a véralvadási vizsgálathoz a második kémcsőben, használja az elsőt más vizsgálatokhoz, például biokémiai vizsgálatokhoz. Ha először a véralvadási kémcsövet kell kiszívni, szívja az első 5 ml vért egy üres csőbe, és dobja ki megakadályozzák a szöveti tromboplasztin bejutását a mintába.

Közvetlenül az összegyűjtés után a vért óvatosan, habzás nélkül keverje össze a véralvadásgátlóval (3-4-szer fordítsa meg a csövet).

A biológiai anyag összegyűjtése után ellenőrizze a vérmintát. A vérminták alapos vizsgálata segít elkerülni a következő hibákat: helytelen vér/citrát térfogatarány; részben alvadt vér.

A vért a levétel után 45 percen belül szállítják a laboratóriumba. Szállítás közben a vért nem szabad felrázni. A vérmintákat nem szabad 4°C alatti vagy 30°C feletti hőmérsékleten szállítani.

Orvosi laboráns (orvostechnológus) a következőket végzi:

a leadott vér bejövő ellenőrzése, beleértve: 1) annak ellenőrzése, hogy az ajánlóívet megfelelően töltötték-e ki. 2) a kiszállított vérmennyiség elegendőségének ellenőrzése a csövön lévő jel segítségével, 3) a minta vérrögmentességének ellenőrzése a cső lassú megdöntésével.

a leszállított vér centrifugálása, hogy megkapjuk:

vérlemezkékben gazdag plazma ( Centrifugálási paraméterek: rpm = 1000 rpm (kb. 150-200g), centrifugálási idő 5-7 perc.

Az optimális centrifugálási feltételek kiválasztásához a centrifugális erő (g) vezérli őket. Használhatja a következő képletet:

g = 1,118 x 0,00001r x n2,

ahol r a centrifuga sugara - a rotor tengelye és a centrifugafészekben lévő kémcső közepe közötti távolság centiméterben; n - percenkénti fordulatok száma.

vérlemezkékben szegény plazma ( centrifugálási paraméterek: rpm = ~2500-3000 rpm (kb. 1500-2000g), centrifugálási idő 10-20 perc. A vérlemezkék teljes eltávolításához ismételt centrifugálást végzünk, a centrifugálási paraméterek változatlanok maradnak.

3. Centrifugálás után a plazma színét és átlátszóságát ellenőrizzük: hemolizált minta, icterikus vagy lipémiás (chylous) plazma nem vizsgálható.

Centrifugálás után a felülúszót összegyűjtjük.

Lehetőleg alatt vizsgálja meg a hemosztázis paramétereit 2 órával a vérvétel után, De megengedett koagulológiai paraméterek vizsgálata in 4 órán belül , ha a plazmát elválasztották az eritrociták és leukociták üledékétől.

Ha szükséges hosszú távú tárolás„friss” minták (legkésőbb 2 órával a vérvétel után) vérlemezkementes plazma egyszer lehetséges befagyasztásáraés -20 °C-on legfeljebb 2 hétig, -70 °C-on pedig legfeljebb 6 hónapig tárolható. A plazmát gyorsan fel kell olvasztani meleg vízben (+36°C), alaposan össze kell keverni és azonnal meg kell vizsgálni. Fagyás után az aPTT-ben változások következhetnek be.

A hematológiai vizsgálatokhoz szükséges mikrolemezek elkészítésének módszerei, rögzítési és festési módszerek.

Vérkenetek készítésének módszerei hematológiai vizsgálatokhoz.

Üveg előkészítése és feldolgozása. Új, tiszta poharak használhatók a Nikiforov-féle keverékben történő zsírtalanítás után (egyenlő arányban 96%-os etil-alkohol és éter). A használt poharakat 24 órán át meleg szappanos oldatban vagy mosóporos oldatban áztatják (1 evőkanál por 5 liter vízhez). Egy nap múlva az oldatot lecsepegtetjük, és az üveget folyó vízzel mossuk. Ezután ismét megtöltjük meleg szappanos oldattal vagy mosópor oldattal, és felforraljuk, ugyanabban az oldatban forraljuk 5-10 percig (nem tovább, hogy elkerüljük az üveg elhomályosodását). Az oldat lehűlése után ismét lecsepegtetjük, az üveget folyó vízzel leöblítjük, és minden poharat folyó víz alatt kefével lemosunk. Az így kezelt poharakat tiszta lapra fektetjük, hogy megszáradjanak. A zsírtalanításhoz használt tiszta poharakat Nikiforov keverékébe vagy 96%-os etil-alkoholba helyezzük 60 percre, majd szárazra töröljük és tiszta, széles nyakú edényben tároljuk. A tiszta üveget ajánlatos csipesszel vagy kézzel megfogni az oldalsó éleinél fogva.

Kenetek készítése. Egy kis vércseppet csepegtetünk egy száraz előkészített tárgylemezre, közelebb a rövid oldalához egy üvegrúd segítségével (vagy közvetlenül az ujjszúrás helyéről). Hagyja az üveget vízszintes helyzetben, és 45°-os szögben tartva száraz, tiszta, csiszolt üveggel kenje be a vért az üvegre. Egy rövid éllel, miután megvárta, amíg az összes vér elterül rajta, gyorsan húzza át a tárgylemezen. Ne nyomja erősen a tárgylemezt, mert ez károsíthatja a vérsejteket. A keneteket levegőn szárítjuk és megjelöljük (lehetőleg egyszerű ceruzával). A megszáradt kenetnek egyenletesen vékonynak, sárgás színűnek, megfelelő méretűnek kell lennie, az üveg széleitől 1,0-1,5 cm távolságra kell elhelyezkednie, szinte a pohár teljes hosszát el kell foglalnia, és „habverőben” kell végződnie. Vastag (sűrű rózsaszín) kenetet nem szabad használni, mivel ezekben nehéz megkülönböztetni a sejtmorfológiát.

A szabványos, kiváló minőségű keneteket különböző cégek által gyártott, kenet készítésére tervezett automata eszközökkel nyerik.

Vérkenetek rögzítése és festése. A festés előtt a vérkeneteket általában 5-10 percig metil-alkoholban rögzítik, hogy megakadályozzák a hemolízist, amely a vízben oldódó festékkel történő festés során vízzel való érintkezéskor vagy vízzel való későbbi érintkezéskor fordulhat elő. Az alábbiakban a rögzítési technikákat a festési technikákkal együtt ismertetjük. Wright és Leishman festéshez nincs szükség rögzítésre, mivel ezek a festékek metil-alkoholt tartalmaznak.

A száraz kenet száraz, meleg helyen 2 napig tárolható, forró, párás légkörben fixálás nélkül sokkal kevésbé tartós.

A vérsejtek bazofil és acidofil struktúrákat tartalmaznak, amelyek reakciójukban (pH) különböznek. A magok bazofilek és kék színűek. Az erősen bazofil (savas) bazofil granulátumok is kékek. A hemoglobin (lévén bázikus) acidofil, azaz vörösre festődik. A savas és bázikus színezékek kombinációjával végzett festést Romanovsky-festésnek nevezik, és különféle módosításokkal rendelkezik (Pappenheim, Wright, Nocht, Leishman, Giemsa, Janer stb.). Főfestékként általában a metilénkéket használják, de a toluidinkéket is használják. A használt savas színezékek az eozin, azúr I és azúr II.

A jó festődés kritériumai: az eritrociták rózsaszín színe, a neutrofilek szemcsézettségének lila festése rózsaszín alapon, a monociták finom azurofil szemcséssége.

A festék hígításához a legjobb, ha semleges, friss desztillált vizet használ. Az állott desztillált víz savassá válik a légkör szén-dioxid megkötése miatt. Ha a desztillált víz lúgos, a vörösvértestek piszkos kékes-zöld színűvé válnak; a kékre festendő leukociták egy része lila árnyalatot kap, az eozinofil szemcsék rózsaszín helyett kékesek és zöldesek lesznek, a neutrofil szemcsék pedig átszíneződnek. A savas vízben a vörösvértestek élénk narancssárgává válnak, a fehérvérsejtek magjai pedig nagyon halványak. Az ideális a 7,0 pH-jú desztillált víz, amelyet puffereléssel őrzünk meg. Használhat desztillált vízben feloldott, használatra kész puffertablettákat.

A csontvelő-kenetek festésére a 7,4-7,5 pH az ideális.

A Nocht és Pappenheim szerinti festési módszereket egységesként fogadták el.

Rögzítési reagensek: 1) metil-alkohol vagy 2) eozin-metilénkék oldat May-Grunwald szerint.

Reagensek színező kenetekhez a Nokht szerint: 1) azúr I bázikus oldata: 1 g festéket 1 liter desztillált vízben feloldunk, sötét üvegedényben 12-14 napig szobahőmérsékleten hagyjuk, majd felhasználjuk; 2) kálium-eozin bázikus oldata: 1 g festéket feloldunk 1 liter desztillált vízben, sötét üvegedényben 12-14 napig szobahőmérsékleten hagyjuk, majd felhasználjuk; 3) foszfát puffer (Weise keverék), pH 7,4-7,5: keverjünk össze 0,49 g kálium-dihidrogén-foszfátot (KH2PO4) és 0,909 g nátrium-hidrogén-foszfátot (Na2HPO4), és oldjuk fel 1 liter desztillált vízben; 4) azúr-eozin munkaoldat: használat előtt keverjünk össze 25 ml azur II törzsoldatot, 20 ml kálium-eozin törzsoldatot és 55 ml pufferoldatot (a színezékek aránya változhat, kísérletileg állapítjuk meg friss készítésekor törzsoldatok tételei).

Reagensek a kenetek festésére Pappenheim szerint: 1) eozin-metilénkék oldat May-Grunwald szerint. Kész festékoldat hiányában 1 g száraz festék 1 liter metil-alkoholban való feloldásával állítják elő; 2) azúr-eozin munkaoldata a Nokht. szerint.

A stroke rögzítése. A rögzítőoldatot küvettába vagy széles nyakú, köszörült dugós edénybe öntik. A keneteket egy edénybe helyezzük, amelyet küvettába merítünk, vagy egyenként egy edénybe tesszük 5-10 percre. A poharakat tartalmazó edényt eltávolítjuk a rögzítőoldatból (vagy a poharakat csipesszel eltávolítjuk és állványra helyezzük), és a levegőn hagyjuk, amíg teljesen meg nem szárad.

Festés a Nokht. A szárított rögzített löketeket anélkül, hogy eltávolítanánk a tartályból, egy küvettába helyezzük működő festékoldattal egy szigorúan meghatározott időre (20–45 perc), amelyet kísérletileg választanak ki minden egyes festéktételhez. Ha nincs edényes küvetta, az üveget vízszintesen két párhuzamosan elhelyezett üvegrúdra („sínre”) helyezzük felfelé húzással, és rájuk öntjük 3-4 ml munkafesték-oldatot. Vegye ki a poharakat tartalmazó edényt a festékkel ellátott küvettából, és helyezze egy csapvizes küvettába (ha nincs tartály, mossa le vízzel a festéket a poharakról anélkül, hogy eltávolítaná azokat az üvegrudakról). A keneteket levegőn szárítjuk.

Pappenheim festés. A száraz, fixálatlan vérkenetet egy edénybe helyezzük, és 3-5 percre May-Grunwald oldatos küvettába engedjük (vagy 3-4 ml festéket pipettázunk a nem rögzített kenetre). A keneteket tartalmazó edényt desztillált vízzel küvettában öblítjük, majd 8-15 percre Nocht szerint azúr-eozinfestékes küvettába helyezzük. A „sínekre” helyezett üvegen a festék leeresztése nélkül adjunk hozzá 1 percig desztillált vizet, majd 8-15 percig öntsünk festéket a kenetre, majd mossuk le a festéket vízzel. A keneteket levegőn szárítjuk.

Festés Romanovsky-Giemsa szerint. Ugyanúgy gyártják, mint a Nokht szerint. Festékként kész Romanovsky-Giemsa oldatot használnak, amelyet felhasználás előtt 1 csepp festék/1 ml desztillált víz arányban hígítanak. A színezési időt kísérletileg határozzuk meg minden egyes festéktételnél (25-40 perc).

Wright festés. Reagensek. 0,2 g Wright-festéket (száraz por, BDH/E. Merck) feloldunk 100 ml metil-alkoholban, és néhány napig állni hagyjuk. Ha a vörösvértestek nem festődnek elég tisztán, készítsen 0,25%-os vagy 0,3%-os oldatot.

A festészet fejlődése. Vigyen fel néhány (kb. 8) csepp festéket a kenetre, hagyja állni 2-3 percig (ügyeljen arra, hogy a festék ne száradjon ki), majd öntsön a kenetre azonos mennyiségű pufferolt vizet. Ha a festék érett, a hígított festék felületén fémes fényű hab vagy film jelenik meg. A hígított festéket 2-3 percig a keneten hagyjuk, majd pufferoldattal vagy vízzel lemossuk. Ne engedje, hogy a festék leülepedjen a vonás felületére. Ha ez megtörténik, a kenetet 15-20 másodpercig hígítatlan festékkel, majd ismét pufferoldattal vagy vízzel töltse fel.

Foszfát puffer készítése.

A oldat (0,2 M KH2PO4): oldjunk fel 27,2 g sót 1 liter desztillált vízben.

B oldat (0,2 M Na2HPO4): oldjunk fel 35,6 g Na2HPO4 × 2H20-at 1 liter desztillált vízben.

Ahhoz, hogy 100 ml pufferoldatot kapjunk a kívánt pH-val, az A és B oldatot a táblázatban megadott mennyiségben le kell engedni. A pH-értéket pH-mérővel ellenőrizzük.

Foszfát puffer oldat készítése

oldat, ml	PH érték

Leishman festés. Reagensek. 0,15 g száraz Leishman festéket feloldunk 133 ml abszolút metil-alkoholban. A festéknek teljesen fel kell oldódnia, a festékkristályokat célszerű először mozsárban őrölni. A festéket üvegdugóval lezárt palackban tároljuk, ne szűrjük.

A festészet fejlődése. A Wright-festéshez hasonlóan végezze el, de a pufferoldat kétszeres hígításával. Néhány csepp festéket (körülbelül 8) a kenetre öntjük, és 2 percig hagyjuk állni. Adjunk hozzá dupla mennyiségű pufferoldatot (16 csepp), keverjük össze rázással, és hagyjuk állni 7-10 percig. A festéket 2-3 másodpercig desztillált vízzel mossuk le. Hosszabb öblítéssel a szín romlik. A keneteket állványon levegőn szárítjuk.

Sűrű vércsepp előkészítése. Egymástól bizonyos távolságra egy tárgylemezre felvitt három csepp vért egy tiszta tárgylemez sarkával körülbelül 1 cm átmérőjűre kitágítjuk, ceruzával megjelöljük, majd levegőn szárítjuk 1-2 percig. órák.

Sűrű vércsepp színezése. A vastag vércseppeket nem rögzítik. A jól megszáradt vastag cseppeket tartalmazó tárgylemezeket egymástól bizonyos távolságra „sínekre” helyezzük, és 8-10 percre rájuk öntjük a Nocht szerinti azúrkék-eozin munkaoldatot. Megtörténik a vörösvértestek „kimosódása”. Ezután a festéket lecsepegtetjük, és a Nokht szerinti azúrkék-eozin munkaoldat új adagját 30-35 percig a készítményekre öntjük. Ezt követően a tárgylemezeket desztillált vízzel gondosan leöblítjük és megszárítjuk.

A kenetek automatikus színezése

Mivel a hematológiai laboratóriumban az egyik legszükségesebb feladat a vérkenetek elkészítése és festése, természetes az automatizálási kísérletek.

Az első automatikus kenetelőkészítő rendszert a Sysmex (Japán) fejlesztette ki még 1990-ben, és jelenleg több mint 1600 rendszer van telepítve világszerte. Az ebben az időszakban megszerzett hatalmas tapasztalatokat egy új generációs rendszer kifejlesztésében használták fel - egy teljesen automatizált SP-1000i kenet készítésére és festésére alkalmas állomás óránként akár 120 kenetet is. Az SP-1000i az intelligens ékmódszer alkalmazásának köszönhetően magas fokú szabványosítást és minőségi kenetkészítést ér el, amely lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy a vizsgált minta hematokritjától függően állítsa be a felvitt vérminta térfogatát, a a szórólapát szöge, a kijuttatási sebesség és a várakozási idő, 8-16 különböző szabályozási szint használatával. A vérvétel történhet manuálisan vagy automatikusan nyitott vagy zárt csövekből. Automatizált állomás kenetek készítésére és festésére SP-1000i a Sysmextől (Japán)

A rendszer akár hét rugalmas festési protokollt használ a festési kenetek minőségének szabványosítására és a legmagasabb követelmények teljesítésére. A következő kettős és egyszeres festési protokollok használhatók: May-Grunwald-Giemsa, Romanovsky és Romanovsky-Giemsa. A vérkeneteket egy dedikált kazettás rendszerben festik meg, amely kazettánként csak egy tárgylemezt tartalmaz. Ezzel a módszerrel a vérkenet és a festőreagensek közötti jó kapcsolat garantált, és nem párolog a reagensből a metanol a levegőbe. A vér jó rögzítésének biztosítása érdekében a festés előtt egy külön metanolos előfixálási lépést integrálnak a festési folyamatba.

A festési protokoll rugalmassága miatt a csontvelő festésére speciális protokoll alkalmazható.

A hematológiai vizsgálatokhoz szükséges csontvelő-kenetek készítésének módszerei.

Csontvelővizsgálat – mielogram Az első kérdés, amelyre a csontvelő-vizsgálatnak meg kell válaszolnia, a sejtek mennyiségi vonatkozása. Köztudott, hogy a perifériás vérrel kapcsolatban számos számszerű érték határozható meg a különböző típusú sejtek számára és százalékára vonatkozóan, mivel ezek szabad állapotban vannak, és viszonylag egyenletesen oszlanak el a vaszkuláris vérszuszpenzióban. A csontvelőről egészen más mondható el: a vérképző szövet összetétele nagyon heterogén, a csontvelősejtek eloszlása ​​pedig egyenlőtlen. Így a mielokariociták közvetlen száma a kamrában nagyon tág határok között változik, mind normál körülmények között, mind ugyanazon a betegségen belül. Az általunk azonosított értékek normál egyénekben 27 000 és 112 000 nukleáris elem/mm3 (Ursya) között voltak. A szakirodalmi adatok még szélesebb körben mozognak, 12 000 és 300 000/mm3 határértékkel (Cartwright, Page). Centrifugálás után a következő 4 réteg található a hematokrit csőben: 1) felső vastag sárga réteg; 2) plazma; 3) nukleáris sejtekből képződött szürkés-fehéres réteg; 4) a vörös réteg, amely vörösvértestekből áll. A nukleáris sejtek szürkés-fehéres rétegének (mielocrit) mérése korlátozott értékű, sőt félrevezető, mivel a közölt értékek normál egyedeknél is nagy eltéréseket mutatnak. Ráadásul a nukleáris sejtek nemcsak ebben a rétegben találhatók, hanem a zsír- és eritrocitarétegekben is. De a kénfehér rétegből a felülúszó plazma eltávolítása után csontvelő-koncentrátum keneteket lehet készíteni. Hasznosnak bizonyultak a diagnosztikai folyamatban olyan esetekben, amikor a közvetlen kenet sejtszegénysége. Tekintettel arra, hogy a mielokariociták kamrás számlálása és a mielokrit meghatározása csak közelítő eredményeket ad korlátozott reprodukálhatóság mellett, ezek a mennyiségi meghatározási módszerek nem kielégítőek. A leszívás során eltávolított anyag egy csontvelő-minta, amely változó arányban vérrel keveredik. A csontvelő vérrel való hígításának mértéke számos tényezőtől függ. A 32P jelölés bebizonyította, hogy a leszívott csontvelő vérrel való hígítása 40% és 100% között van. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csontvelő vizsgálata a diagnózis felállítása céljából elsősorban a sejttartalom kvalitatív vizsgálatán, és csak másodsorban e tartalom mennyiségi értékén alapul. Éppen ezért a csontvelősejtek meghatározásának kvantitatív módszerei a csontvelő sejtösszetételének félkvantitatív értékeléséből állnak, összehasonlítva a normál mintákkal, a következőkön: a) zúzott csomókat tartalmazó kenetek; b) szövettani metszetek. A kenetvizsgálat elsősorban száraz lencsével, több keneten történik, az alábbi célokkal: a) a csontvelő sejttömegének félkvantitatív felmérése; b) a megakariociták jelenlétének és sűrűségének meghatározása; c) óriássejtek vagy abnormális sejtek fészkeinek azonosítása; d) az immerziós kutatás számára legalkalmasabb területek meghatározása. A csontvelő-részecskék aprításával kapott keneteken a következő három koncentrikus zóna különböztethető meg: a) központi; b) külső; c) köztes. A központi zónát zsírvakuolák, stromasejtek, granulociták és számos elpusztult sejt alkotják. A külső zóna nagy mennyiségű vért tartalmaz, amely cseppfolyósítja a csontvelő sejteket. A vékony kenetekhez hasonlóan csak a mieloid sejtek és a vörösvértestek morfológiai részleteinek tanulmányozásában segít. A köztes zóna tartalmazza a legsűrűbb sejttömeget, ami lehetővé teszi az optimális kutatást, amely minden tervezett kérdést tisztázhat. Itt a csontvelősejtek jól megőrződnek és szigetekbe vagy fészkekbe rendeződnek, pontosan úgy, ahogy a csontvelőben megfigyelhető. A csontvelő topográfiájának megőrzésével a zóna vizsgálatával kapott eredmények homogénebbek és megfelelnek a csontvelő aktuális állapotának, amit a szövettani képekkel való összehasonlítás is megerősít. A sejtsűrűség félkvantitatív meghatározását a következőképpen fejezzük ki: a) normál, b) dús vagy c) a normálhoz képest szegény csontvelő. A normál vagy bőséges sejttömeg kimutatása értékes eredmény, míg a szűkös csontvelőt óvatosan kell mérlegelni. A tényleges hypoplasia jelenlétének bizonyításához több lemezt kell megvizsgálni, több csontos területen punkciót és/vagy csontbiopsziát kell végezni. A csontvelői sejttömegről a legpontosabb információt a szövettani metszetek vizsgálatával nyerjük. Felnőtteknél a zsír és az aktív sejtparenchima által elfoglalt tér normál aránya 1:1 vagy 2:1. Egyes szerzők a csontvelőt hipocellulárisnak tekintik, ha a vérképző sejtek a csontvelő csomóinak kevesebb mint negyedét foglalják el. A diagnózis felállításához elengedhetetlen a kvalitatív csontvelő-vizsgálat. Merítéssel hajtják végre, mind vékony keneteken, mind különösen a közbenső zónából származó zúzott csomókat tartalmazó keneteken. Javasoljuk, hogy a legjobb, megfelelően feszített és festett keneteket válasszuk ki, jól látható és morfológiailag jól megőrzött sejtekkel. A tanulmány célja: a) a mieloid sejtek különböző típusainak azonosítása; b) az egyes sejtsorok érettségi fokának meghatározása; c) a granulociták és eritroblasztok (G/E) kapcsolatának tisztázása d) a mitózis fázisban lévő sejtek azonosítása; e) a talált atipikus sejtek leírása. Több kenet vizsgálata után vagy egy részletes leíró „mielogramot” állítanak össze (amely a kenetek megfejtése után levont következtetéseket tartalmazza), vagy egy százalékos mielogramot, amelyet legalább 300-500 elemből állítanak össze. A százalékos mielogram összeállításának két módja van: 1) a fennmaradó sejtsorok hozzárendelése 100 granulocitához; 2) az egyes sejttípusok százalékos megjelenítése a csontvelősejtek teljes számából. Statisztikai szempontból ez utóbbi módszer tűnik helyesebbnek, és láthatóan a csontvelő sejtösszetételének valós képét tükrözi. Az egyes szerzők által megállapított képletek jelentősen eltérnek egymástól, mivel nehéz meghatározni a valódi átlagértékeket egy ilyen heterogén szövetben, mint a csontvelő. A táblázat Wintrobe szerint 12 egészséges egyén kiválasztott csontvelőmintáinak vizsgálatának eredményeit mutatja be. Normál mielogram

Mielogram indikátorok Átlagos érték (%) Ingadozási tartomány (%)

Retikuláris sejtek 0,9 0,1-1,6 Differenciálatlan blasztok 0,6 0,1-1,1 Myeloblastok 1,0 0,2-1,7

Promielociták 2,5 1,0-4,1

Neutrophil mielociták 9,6 7,0-12,2 Metamielociták Neutrophilek 11,5 8,0-15,0 Sáv neutrofilek 18,2 12,8-23,7 Szegmentált neutrofilek 18,6 13,1-24,1 A neutrofil sorozat összes sejtje 60,8 52,7-68,9 Eozinofil mielociták 0,1 0,0-0,2 Eozinofil metamielociták 0,2 0,1-0,4 Eozinofilek 2,8 0,4-5,2

Az eozinofil sorozat összes sejtje 3,2 0,5-5,8 Basophil mielociták 0,1 0-0,3

Bazofilek 0,1 0-0,3

A bazofil sorozat összes sejtje 0,2 0-0,5 Limfoblasztok 0,1 0-0,2

Prolimfociták 0,1 0-0,2

Limfociták 8,8 4,3-13,3

Összes limfoid sejt 9,0 4,3-13,7 Monoblasztok 0,1 0-0,2

Monociták 1,9 0,7-3,1

Plazmablasztok 0,1 0-0,2

Proplazmociták 0,1 0,1-0,2

Plazmasejtek 0,9 0,1-1,8

Eritroblasztok 0,6 0,2-1,1

Bazofil normoblasztok 3,6 1,4-5,8 Polikromatofil normoblasztok 12,9 8,9-16,9 Oxifil normoblasztok 3,2 0,8-5,6

Összes eritroid sejtek 20,5 14,5-26,5 Megakariociták 0,4 0,2-0,6

Egészséges embereken végzett vizsgálataink szerint az eredmények a következők:

számos granulocita 56-70%,

eritroblaszt sorozat 23-30%, limfoplazmacita sorozat 5-10%, monocitomakrofág sorozat 1-2% és megakariocita sorozat 0,1-0,8% (Ursya). A normál mieloid sorozatok arányának változása vagy abnormális sejtekkel való helyettesítése gyakran utal a betegség típusára. A retikuláris sejtek ritkábban és kis számban jelennek meg. Egészen véletlenül osteoblastok és/vagy oszteoklasztok találhatók a keneteken (vagy csontvelő-lenyomatokon), amelyeket nem szabad összetéveszteni a daganatos sejtekkel. Jelenlétüket gyakrabban észlelik gyermekeknél, ritkábban felnőtteknél primer myelofibrosisban vagy másodlagosan, karcinómás metasztázisban, akut leukémiában, osteoporosisban stb. A H/E arányt úgy kapjuk meg, hogy a granulociták számát elosztjuk az eritroblasztok számával. Normál felnőttnél ez az arány átlagosan 3/1 vagy 4/1, a becsült határértékek 2/1 (ha csak éretlen granulocitákat tartalmaznak) és 5/1 (ha minden granulocitát, legyen az érett és éretlen). A G/E arány az életkorral ingadozik: születéskor kicsi (1,8/1), 2 hetes korban 11/1-re emelkedik, majd fokozatosan csökken, egyéves gyermekeknél pedig eléri a felnőtt értékeket. A H/E arány normális globális csontvelő-hipo- vagy hiperplázia esetén, valamint olyan egyedi sejtek proliferációjában, amelyek nem szerepelnek ezen arány számításában, például plazmacitómában. Leukémiákban, leukómaszerű reakciókban és erythroblastopeniákban magas az arány, míg erythroblastos hyperplasiával járó anémiákban alacsony, vagy éppen ellenkezőleg (megaloblasztos, hemolitikus anémia). A kenetek vizsgálata után kapott mielográfiai adatok kiadása előtt tisztázni kell: a) a szúrás helyét; b) csontsűrűség; c) a szívás körülményeit; d) a kiválasztott anyag makroszkopikus vonatkozása. A csontvelő-kutatás egy összetett folyamat, amely számos és változatos adat integrálásán alapul. Eredményének általános jellegű következtetéseket kell tükröznie, amelyek inkább következtetéseken alapulnak, mint az egyes alakok mechanikus rögzítésén, amelyek ráadásul ingadoznak. Bármely mielográfia következtetésének tisztáznia kell a diagnózist vagy a csontvelő-vizsgálatból eredő további vizsgálatok indikációit. Vérbetegségek esetén a szívószúrás az esetek 80%-ában kenetekkel, csomós metszetekkel segíti a diagnózis tisztázását. Más esetekben csontbiopszia és a csontvelő szövettani vizsgálata indokolt. Bioptikus szelekció és szövettani vizsgálat szükségesnek tűnik: a) primer vagy szekunder myelofibrosis esetén; b) csontvelő aplasia vagy hypoplasia; c) granulomatosus típusú elváltozásokkal járó betegségek (pl. , Godgkin-kór, szarkoidózis, tuberkulózis stb.); d) karcinómás metasztázis; e) minden olyan esetben, amikor a szúrással kiválasztott anyag nem bizonyul kielégítőnek, vagy a csontvelői szempont nem meggyőző. A bioptikus mintavételt követően citológiai vizsgálatra lenyomatokat készítünk, mivel a szövettani metszetek kevés információt adnak a zsúfolt, nem szórt, nem maratott vérképző sejtek szerkezeti részleteiről. Ezenkívül a kötődés sejtvisszahúzódást okoz, és a szövettani festés kevésbé szelektív, mint a citológiai festés. Éppen ezért a csontvelő teljes körű vizsgálata magában foglalja mind a citológiai - keneteken vagy lenyomatokon, mind a szövettani - vizsgálati szakaszokon. Emlékeztetni kell arra, hogy a csontvelő tanulmányozására szolgáló citológiai és szövettani módszerek nem zárhatók ki, hanem éppen ellenkezőleg, kiegészítik egymást: a biopszia kvantitatív és architekturális módszer, míg a mielogram kvalitatív és citológiai.

A vérsejtek számlálásának módszertana a Gorjaev-kamrában.

Gorjajev kamerája - egy adott térfogatú folyadékban lévő cellák számának megszámlálására tervezett eszköz. Általában a képződött elemek számának meghatározására szolgál a vérmintában. A kamrák vastag üveglemezből állnak, amelyen keresztirányú hasítékok vannak kialakítva, amelyek három, keresztirányban elhelyezkedő lapos területet alkotnak. A középső platformot egy hosszirányú rés osztja ketté, mindegyiken rács van gravírozva. A Gorjaev-kamra középső emelvényének mindkét oldalán van még két másik 0,1 mm-rel (a Fuchs-Rosenthal kamrában 0,2 mm-rel) a középső felett. Ezeknek a területeknek a síkjai a fedőüveg csiszolására szolgálnak az úgynevezett newtoni gyűrűk megjelenéséig. A fedőüveg dörzsölése után két oldalról zárt kamra jön létre, a másik kettőn pedig rések (kapillárisok) vannak, amin keresztül a kamra feltöltődik. A rácsok elve ugyanaz. Egy vagy több négyzetre vannak osztva, különféle módon csoportosítva. Minden rácsban állandó érték az ún. „kis négyzet”, amelynek oldala 1/20 mm, tehát területe 1/400 mm2. A Goryaev kamera segítségével a mikroszkóp nagyítása is meghatározható. Külsőleg átlátszó paralelepipedon (tolóüveg), hornyokkal és felvitt mikroszkopikus hálóval. A kis hálós sejtosztódások méretei 0,05 mm, a nagyoké 0,2 mm. Ebben az esetben a hálót a két szomszédos területnél 0,1 mm-rel alacsonyabban lévő területre (üvegszakaszra) kell felhordani. Ezeket a párnákat a fedőüveg csiszolására használják. Ennek eredményeként a Gorjaev-rács nagy felosztása által alkotott négyzet feletti folyadék térfogata 0,004 mikroliter. Egy nagy négyzet feletti cellák számának megszámlálásával kiszámíthatja egy adott sejttípus szuszpenzióban lévő sűrűségét a következő képlet segítségével: Sejtszám/ml = cellák száma a nagy négyzet felett * 2,5 10^5 A Goryaev-kamerát egyfajta szabványként használva meghatározhatja a mikroszkóp nagyítását a képlet segítségével: Kg=(m2-m1)/(a*N) Ahol kG- ez a mikroszkóp nagyítása; m 1 - a Goryaev-sejt bal szélének helyzete; m 2 - egy cella vagy cellacsoport jobb szélének helyzete; N- cellák száma a mért határok között; a- Gorjajev kamrájának cellamérete (0,05 mm). A Gorjaev-kamrát a tenyészetben lévő sejtek számának megszámlálására is használják. Képlet a vérsejtek számlálására Gorjajev kamrájában - x = (a · 400 · c) / b, ahol x a formázott elemek szükséges száma 1 mm3-ben; a az alakos elemek összege a kamra egy bizonyos térfogatában; b - a megszámolt kis négyzetek száma; c - vérhígítás.

Módszer az oociszták számlálására a Gorjajev-kamrában. Ezt a módszert általában akkor alkalmazzák, amikor kísérletileg állatokat fertőznek meg pontosan meghatározott számú oocisztával (megfelelő számú milliliter szuszpenziót fecskendeznek az állatba). 1 ml oocisztákat tartalmazó szuszpenziót helyezünk Gorjajev kamrájába. Mivel a Gorjajev-kamra térfogata 0,9 m3, a megszámlált oociszták számát megszorozzuk 1111-gyel. A kapott szám megfelel az 1 cm3 oldatban lévő oociszták számának. A pontosabb meghatározáshoz legalább háromszor el kell végezni a számításokat, majd le kell számítani a számtani átlagot. A fertőzéshez szükséges oociszták számát beosztásos pipettával mérjük. Az oociszták egyenletesebb eloszlása ​​érdekében az inkubációs közegben a cső tartalmát többször meg kell rázni.

Vörösvérsejtek számolása Gorjajev kamrájában Elv. Pontos mennyiségű vért egyenletesen elkeverünk egy bizonyos mennyiségű folyadékban, és egy ismert térfogatú kamrába helyezzük, amelyben a vérszuszpenzió egy rétegben eloszlik. A kamra alja grafikonnal van ellátva, ami lehetővé teszi a vörösvértestek pontos megszámlálását. Reagensek: 0,9%-os nátrium-klorid oldat. Speciális felszerelés: mikroszkóp, Gorjajev kamra, laboratóriumi kémcsövek vagy kapilláris Sali hemométeréből. Az elhatározás előrehaladása. Adjon 8 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldatot és 0,02 ml vért kapilláris pipettával egy száraz, tiszta kémcsőbe. Először a pipetta hegyét letöröljük, a vért kifújjuk a kémcső aljára, és a pipettát alaposan lemossuk a felső folyadékréteggel. A kémcső tartalmát jól összekeverjük. 1:400-as vérhígítást kapunk, azaz a vér 400-szorosára hígul. Amikor a vér besűrűsödik, célszerű 500, 600, 700, 800-szorosra hígítani. A kamrát és a fedőlemezt ki kell mosni és szárazra törölni. A fedőüveget a kamrához dörzsöljük, így irizáló gyűrűk jelennek meg. Vegyünk egy csepp hígított vért egy kémcsőből, és töltsük meg vele a kamrát, a fedőüveg szélére helyezve A vörösvértesteket a kamra megtöltése után 1 perccel számoljuk meg alacsony nagyítású mikroszkóp alatt (x8 lencse, x10 vagy x). 15 szemlencse) zárt membránnal vagy leengedett kondenzátorral (sötétített látómezőben). A vörösvértesteket öt nagy (vagy 80 kicsi) négyzetben számolják meg, amelyek átlósan helyezkednek el. A kis négyzet belsejében, valamint a bal és a felső falán elhelyezkedő vörösvértesteket figyelembe veszik. A négyzet jobb és alsó sorában található cellák nem számítanak bele. Számítás: A 80 kis négyzetben megszámolt sejtek számát megszorozzuk 20 000-rel 1:400-as vérhígításnál, 25 000-rel 1:500-as hígításnál, vagy 30 000-rel 1:600-as hígításnál, hogy megkapjuk a végső eredményt. milliókat eredményez 1 µl-enként. Feltételezzük, hogy egy kis négyzet térfogata 1/4000 µl. A sejtek 1 literben történő megszámlálásához az 1 µl-ben lévő vörösvértestek számát tovább kell szorozni 1 000 000-rel. Jegyzet. A vérrögökkel végzett vizsgálat nem megengedett; cellák számlálása közvetlenül a kamra feltöltése után (1 perc várakozás nélkül); rosszul mosott és szárított pipetták és kémcsövek, alacsony minőségű reagensek használata, amelyek hemolízist okoznak. Ha minden számítási szabályt betartanak, a hiba átlagosan ±2,5% lesz.

A fertőtlenítés szabályai Használat után Gorjajev kamráját fertőtleníteni kell 3%-os oldat hidrogén-peroxidot, öblítse le desztillált vízzel, és törölje le puha ruhával. A kamerát száraz helyen kell tárolni.

A hematológiai analizátorokon végzett munkamódszerek.

Hematológiai elemzés- kvantitatív kutatás végzésére szolgáló eszköz (berendezéskészlet). sejteket vér klinikai diagnosztikai laboratóriumokban. Lehet automatikus vagy félautomata. A félautomata hematológiai analizátor abban különbözik az automatikustól, hogy a vérminta hígításának folyamatát egy külön készülék - egy hígító - végzi. A teljes vér hígításának elkészítése után a kezelőnek át kell vinnie a hígított mintát a mérőmodulba. Jelenleg félautomata analizátorokat gyakorlatilag nem gyártanak.

Az automatikus hematológiai analizátor egy teljesen automatizált műszer, amelyben a teljes analitikai folyamat automatikusan lezajlik.

A modern automata analizátorok több tucat mintát (60-120) képesek óránként, specifikáció szerinti pontossággal és reprodukálhatósággal feldolgozni, valamint a vizsgálati eredményeket a beépített memóriában tárolni, és szükség esetén beépített készülékre kinyomtatni. hőnyomtató vagy külső nyomtató.

A modern hematológiai analizátorokat a meghatározandó vérsejtparaméterek nómenklatúrája szerint osztályozzák.

Nyolcparaméteres hematológiai analizátorok határozza meg a következő paramétereket: koncentrációk vörös vérsejtek(RBC), leukociták(WBC) vérlemezkék(Plt), hemoglobin(Hb), valamint a következő vörösvértest-paraméterek: átlagos eritrocita térfogat (MCV), átlagos eritrocita hemoglobin tartalom (MCH), átlagos eritrocita hemoglobin koncentráció (MCHC), hematokrit(Hct).

Nyolcparaméteres hematológiai analizátorokat jelenleg gyakorlatilag nem gyártanak.

Hematológiai analizátorok osztály 3-diff. A 3-diff osztályú hematológiai analizátorok az előállított modelltől függően 16-22 vérsejt-paraméter meghatározását teszik lehetővé. Az ebbe az osztályba tartozó analizátorok a nyolcparaméteres analizátorok által meghatározott paramétereken kívül a leukociták három alpopulációját határozzák meg: a limfociták (Lm), a granulociták (Gr) és az ún. átlagos leukociták (Mid) koncentrációját, valamint azok értékét. százalék Lm%, Gr% és Mid%. Innen származik a 3-diff osztály neve. Ezen túlmenően az ebbe az osztályba tartozó hematológiai analizátorok meghatározzák a vörösvértest-térfogat variációs koefficiensét (RDW) és számos, a vérlemezkékre jellemző indikátort: ​​átlagos vérlemezketérfogat (MPV), vérlemezketérfogat-frakció (Tct) (a hematokrit analógja), variációs koefficiens. a trombocita térfogat (PDW).

Az ebbe az osztályba tartozó hematológiai analizátorokkal megszerezhető fontos diagnosztikai információk az eritrociták, leukociták és vérlemezkék térfogateloszlási függvényei - hisztogramok.

Hematológiai analizátorok osztály 5-különböző. A fő különbség az 5-diff hematológiai analizátorok és a 3-diff analizátorok között az, hogy képesek meghatározni a leukociták mind az 5 alpopulációját: limfociták (Lym), monociták (Mon), neutrofilek (Neu), bazofilek (Bas) és eozinofilek (Eos), valamint százalékos Lym%, Mon%, Neu%, Bas% és Eos% tartalmuk. Impedanciaszámláló módszer, más néven Csoroszlyaszámláló 3-diff analizátorokban használatos, nem képes különbséget tenni a neutrofilek, a bazofilek és az eozinofilek között, ezért az 5-diff analizátorokban eltérő sejtdifferenciációs módszert alkalmaznak. Az elven alapul diffrakció a leukocita sejtek lézersugárzása és a szórt sugárzás további elemzése. Az „átlagos” leukociták mérete nem különbözik eléggé ahhoz, hogy az impedancia módszerrel megkülönböztesse őket, de eltérő belső szerkezettel rendelkeznek, és eltérően lépnek kölcsönhatásba a festékekkel. És a diffrakciós mintázat kimutatásának módszere érzékeny a sejtek belső szerkezetére. Így a vörösvérsejteket és a vérlemezkéket Coulter-számláló, a fehérvérsejteket pedig külön lézeregység számlálja.

Foszfát-sóoldatos mosópuffer Tween-20-zal immunhisztokémiához egy koncentrátum (20x), amelyet hígítás után reagenslemezek mosására és immunhisztokémiai minták rövid távú tárolására használnak az eljárások között. Hígítás után a felhasználásra kész 0,01 M oldat pH-ja 7,4 ± 0,1. Ennek a foszfáttal pufferelt sóoldatnak a használata nemcsak a kiváló minőségű mosás biztosítását teszi lehetővé, hanem a felhasznált antitestek és epitópjaik morfológiai jellemzőinek megőrzését is, ami elősegíti az immunhisztokémiai reakcióhoz szükséges specifikus kötődést. A Tween-20 hozzáadása a foszfáttal pufferolt sóoldathoz hatékonyabb mosást tesz lehetővé, és megakadályozza a nem specifikus elszíneződést.

Előnyeink:

Jelenleg a laboratóriumi reagensek vezető külföldi gyártóival működünk együtt. Ügyfeleink nem kormányzati és kormányzati intézmények, köztük orvosi szervezetek Moszkvában és Oroszország más városaiban. A rendszeres vásárlók számára kedvezményrendszer biztosított.